打算將一個 cDNA 克隆到一個表達載體,以便在 E.coli 中大量制備相應(yīng)的蛋白質(zhì)。這個cDNA 的兩側(cè)具有 BamHI的位點,因此計劃將它從 BamHI的位點插入載體中。實驗嚴(yán)格地按照克隆手冊中的方法進行:載體用 BamHI切割以后,立即用堿性磷酸酶處理除去 5’磷酸;接著將處理過的載體同用 BamHI切割的 cDNA 片段混合,加入 DNA連接酶后進行溫育,連接之后,將 DNA 同已處理過的可以接受 DNA的細菌感受態(tài)細胞混合。最后,將混合物涂布在加有抗生素固體培養(yǎng)基的平板上。由于載體上帶有抗生素的抗性基因,所以,轉(zhuǎn)化的細菌能夠存活。實驗中同時設(shè)置了 4 個對照: 對照1: 將未同任何載體接觸過的細菌細胞涂布在培養(yǎng)平板上; 對照2: 將未切割載體轉(zhuǎn)化過的細菌細胞涂布在培養(yǎng)平板上; 對照3: 將經(jīng)切割(但未用堿性磷酸酶處理)并用連接酶連接(但沒有cDNA片段)的載體轉(zhuǎn)化過的細菌細胞涂布在培養(yǎng)平板上; 對照4: 將經(jīng)切割(并用堿性磷酸酶處理過)并用 DNA連接酶連接(但沒有cDNA片段)的載體轉(zhuǎn)化過的細 菌細胞涂布在培養(yǎng)平板上。 在進行第一次實驗時,感受態(tài)細胞不是自己制備的,結(jié)果,在所有的平板上都長出了多到無法計數(shù)的菌落(表 2)。在第二次實驗中,自己制備感受態(tài)細胞,但這一次,所有的平板上都沒有菌落生長(表 2)。接著又進行了第三次實驗,這次得到了轉(zhuǎn)化子(表 2)。從實驗平板上挑出 12 個菌落,分離了質(zhì)粒 DNA,并用 BamHI進行切割,其中 9個克隆產(chǎn)生大小同載體一樣的單一的一條帶,另三個克隆中切出一個cDNA 片段,實驗終于獲得成功。
最新試題
RACE技術(shù)可用于()。
mRNA 消解雜交
下列對逆轉(zhuǎn)錄酶描述正確的是()
簡述Southernblotting 的原理和一般過程。
M13載體現(xiàn)在不被廣泛用作克隆載體的主要原因可能是()
為了防止RNA降解,所用的管子等均需用()處理。
下列哪些酶具有RNase H 活性()
轉(zhuǎn)化通常指()
下面哪一條不是基因工程對載體的要求?()
有兩個限制性內(nèi)切酶的識別位點都是CCCGGG,它們可能是()