問(wèn)答題20世紀(jì)70年代誕生基因工程的理論基礎(chǔ)和技術(shù)基礎(chǔ)是什么？

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1.問(wèn)答題

打算將一個(gè) cDNA 克隆到一個(gè)表達(dá)載體，以便在 E．coli 中大量制備相應(yīng)的蛋白質(zhì)。這個(gè)cDNA 的兩側(cè)具有 BamHI的位點(diǎn)，因此計(jì)劃將它從 BamHI的位點(diǎn)插入載體中。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格地按照克隆手冊(cè)中的方法進(jìn)行：載體用 BamHI切割以后，立即用堿性磷酸酶處理除去 5’磷酸；接著將處理過(guò)的載體同用 BamHI切割的 cDNA 片段混合，加入 DNA連接酶后進(jìn)行溫育，連接之后，將 DNA 同已處理過(guò)的可以接受 DNA的細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞混合。最后，將混合物涂布在加有抗生素固體培養(yǎng)基的平板上。由于載體上帶有抗生素的抗性基因，所以，轉(zhuǎn)化的細(xì)菌能夠存活。實(shí)驗(yàn)中同時(shí)設(shè)置了 4 個(gè)對(duì)照： 
對(duì)照1：   將未同任何載體接觸過(guò)的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上；       
對(duì)照2：   將未切割載體轉(zhuǎn)化過(guò)的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上；  
對(duì)照3：   將經(jīng)切割（但未用堿性磷酸酶處理）并用連接酶連接（但沒(méi)有cDNA片段）的載體轉(zhuǎn)化過(guò)的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上；  
對(duì)照4：   將經(jīng)切割（并用堿性磷酸酶處理過(guò)）并用 DNA連接酶連接（但沒(méi)有cDNA片段）的載體轉(zhuǎn)化過(guò)的細(xì)
菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。  
     在進(jìn)行第一次實(shí)驗(yàn)時(shí)，感受態(tài)細(xì)胞不是自己制備的，結(jié)果，在所有的平板上都長(zhǎng)出了多到無(wú)法計(jì)數(shù)的菌落（表 2）。在第二次實(shí)驗(yàn)中，自己制備感受態(tài)細(xì)胞，但這一次，所有的平板上都沒(méi)有菌落生長(zhǎng)（表 2）。接著又進(jìn)行了第三次實(shí)驗(yàn)，這次得到了轉(zhuǎn)化子（表 2）。從實(shí)驗(yàn)平板上挑出 12 個(gè)菌落，分離了質(zhì)粒 DNA，并用 BamHI進(jìn)行切割，其中 9個(gè)克隆產(chǎn)生大小同載體一樣的單一的一條帶，另三個(gè)克隆中切出一個(gè)cDNA 片段，實(shí)驗(yàn)終于獲得成功。

為什么要用堿性磷酸酶處理載體？
2.問(wèn)答題

打算將一個(gè) cDNA 克隆到一個(gè)表達(dá)載體，以便在 E．coli 中大量制備相應(yīng)的蛋白質(zhì)。這個(gè)cDNA 的兩側(cè)具有 BamHI的位點(diǎn)，因此計(jì)劃將它從 BamHI的位點(diǎn)插入載體中。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格地按照克隆手冊(cè)中的方法進(jìn)行：載體用 BamHI切割以后，立即用堿性磷酸酶處理除去 5’磷酸；接著將處理過(guò)的載體同用 BamHI切割的 cDNA 片段混合，加入 DNA連接酶后進(jìn)行溫育，連接之后，將 DNA 同已處理過(guò)的可以接受 DNA的細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞混合。最后，將混合物涂布在加有抗生素固體培養(yǎng)基的平板上。由于載體上帶有抗生素的抗性基因，所以，轉(zhuǎn)化的細(xì)菌能夠存活。實(shí)驗(yàn)中同時(shí)設(shè)置了 4 個(gè)對(duì)照： 
對(duì)照1：   將未同任何載體接觸過(guò)的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上；       
對(duì)照2：   將未切割載體轉(zhuǎn)化過(guò)的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上；  
對(duì)照3：   將經(jīng)切割（但未用堿性磷酸酶處理）并用連接酶連接（但沒(méi)有cDNA片段）的載體轉(zhuǎn)化過(guò)的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上；  
對(duì)照4：   將經(jīng)切割（并用堿性磷酸酶處理過(guò)）并用 DNA連接酶連接（但沒(méi)有cDNA片段）的載體轉(zhuǎn)化過(guò)的細(xì)
菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。  
     在進(jìn)行第一次實(shí)驗(yàn)時(shí)，感受態(tài)細(xì)胞不是自己制備的，結(jié)果，在所有的平板上都長(zhǎng)出了多到無(wú)法計(jì)數(shù)的菌落（表 2）。在第二次實(shí)驗(yàn)中，自己制備感受態(tài)細(xì)胞，但這一次，所有的平板上都沒(méi)有菌落生長(zhǎng)（表 2）。接著又進(jìn)行了第三次實(shí)驗(yàn)，這次得到了轉(zhuǎn)化子（表 2）。從實(shí)驗(yàn)平板上挑出 12 個(gè)菌落，分離了質(zhì)粒 DNA，并用 BamHI進(jìn)行切割，其中 9個(gè)克隆產(chǎn)生大小同載體一樣的單一的一條帶，另三個(gè)克隆中切出一個(gè)cDNA 片段，實(shí)驗(yàn)終于獲得成功。

對(duì)照3 和4 各有什么作用？
3.問(wèn)答題

打算將一個(gè) cDNA 克隆到一個(gè)表達(dá)載體，以便在 E．coli 中大量制備相應(yīng)的蛋白質(zhì)。這個(gè)cDNA 的兩側(cè)具有 BamHI的位點(diǎn)，因此計(jì)劃將它從 BamHI的位點(diǎn)插入載體中。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格地按照克隆手冊(cè)中的方法進(jìn)行：載體用 BamHI切割以后，立即用堿性磷酸酶處理除去 5’磷酸；接著將處理過(guò)的載體同用 BamHI切割的 cDNA 片段混合，加入 DNA連接酶后進(jìn)行溫育，連接之后，將 DNA 同已處理過(guò)的可以接受 DNA的細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞混合。最后，將混合物涂布在加有抗生素固體培養(yǎng)基的平板上。由于載體上帶有抗生素的抗性基因，所以，轉(zhuǎn)化的細(xì)菌能夠存活。實(shí)驗(yàn)中同時(shí)設(shè)置了 4 個(gè)對(duì)照： 
對(duì)照1：   將未同任何載體接觸過(guò)的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上；       
對(duì)照2：   將未切割載體轉(zhuǎn)化過(guò)的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上；  
對(duì)照3：   將經(jīng)切割（但未用堿性磷酸酶處理）并用連接酶連接（但沒(méi)有cDNA片段）的載體轉(zhuǎn)化過(guò)的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上；  
對(duì)照4：   將經(jīng)切割（并用堿性磷酸酶處理過(guò)）并用 DNA連接酶連接（但沒(méi)有cDNA片段）的載體轉(zhuǎn)化過(guò)的細(xì)
菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。  
     在進(jìn)行第一次實(shí)驗(yàn)時(shí)，感受態(tài)細(xì)胞不是自己制備的，結(jié)果，在所有的平板上都長(zhǎng)出了多到無(wú)法計(jì)數(shù)的菌落（表 2）。在第二次實(shí)驗(yàn)中，自己制備感受態(tài)細(xì)胞，但這一次，所有的平板上都沒(méi)有菌落生長(zhǎng)（表 2）。接著又進(jìn)行了第三次實(shí)驗(yàn)，這次得到了轉(zhuǎn)化子（表 2）。從實(shí)驗(yàn)平板上挑出 12 個(gè)菌落，分離了質(zhì)粒 DNA，并用 BamHI進(jìn)行切割，其中 9個(gè)克隆產(chǎn)生大小同載體一樣的單一的一條帶，另三個(gè)克隆中切出一個(gè)cDNA 片段，實(shí)驗(yàn)終于獲得成功。

影響第二次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的原因是什么？對(duì)照2 的作用何在？
4.問(wèn)答題

打算將一個(gè) cDNA 克隆到一個(gè)表達(dá)載體，以便在 E．coli 中大量制備相應(yīng)的蛋白質(zhì)。這個(gè)cDNA 的兩側(cè)具有 BamHI的位點(diǎn)，因此計(jì)劃將它從 BamHI的位點(diǎn)插入載體中。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格地按照克隆手冊(cè)中的方法進(jìn)行：載體用 BamHI切割以后，立即用堿性磷酸酶處理除去 5’磷酸；接著將處理過(guò)的載體同用 BamHI切割的 cDNA 片段混合，加入 DNA連接酶后進(jìn)行溫育，連接之后，將 DNA 同已處理過(guò)的可以接受 DNA的細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞混合。最后，將混合物涂布在加有抗生素固體培養(yǎng)基的平板上。由于載體上帶有抗生素的抗性基因，所以，轉(zhuǎn)化的細(xì)菌能夠存活。實(shí)驗(yàn)中同時(shí)設(shè)置了 4 個(gè)對(duì)照： 
對(duì)照1：   將未同任何載體接觸過(guò)的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上；       
對(duì)照2：   將未切割載體轉(zhuǎn)化過(guò)的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上；  
對(duì)照3：   將經(jīng)切割（但未用堿性磷酸酶處理）并用連接酶連接（但沒(méi)有cDNA片段）的載體轉(zhuǎn)化過(guò)的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上；  
對(duì)照4：   將經(jīng)切割（并用堿性磷酸酶處理過(guò)）并用 DNA連接酶連接（但沒(méi)有cDNA片段）的載體轉(zhuǎn)化過(guò)的細(xì)
菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。  
     在進(jìn)行第一次實(shí)驗(yàn)時(shí)，感受態(tài)細(xì)胞不是自己制備的，結(jié)果，在所有的平板上都長(zhǎng)出了多到無(wú)法計(jì)數(shù)的菌落（表 2）。在第二次實(shí)驗(yàn)中，自己制備感受態(tài)細(xì)胞，但這一次，所有的平板上都沒(méi)有菌落生長(zhǎng)（表 2）。接著又進(jìn)行了第三次實(shí)驗(yàn)，這次得到了轉(zhuǎn)化子（表 2）。從實(shí)驗(yàn)平板上挑出 12 個(gè)菌落，分離了質(zhì)粒 DNA，并用 BamHI進(jìn)行切割，其中 9個(gè)克隆產(chǎn)生大小同載體一樣的單一的一條帶，另三個(gè)克隆中切出一個(gè)cDNA 片段，實(shí)驗(yàn)終于獲得成功。

你如何看待第一次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果？對(duì)照 1 的目的是什么？
5.問(wèn)答題λYES（酵母—大腸桿菌穿梭載體）是構(gòu)建 cDNA 文庫(kù)的高效載體，這種載體是λ噬菌體基因組與一個(gè)在大腸桿菌和酵母中都能復(fù)制的質(zhì)粒巧妙結(jié)合而成，它兼有病毒和質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)。cDNA 被插入載體的質(zhì)粒部分，然后它能在體外被包裝入病毒顆粒中，包裝起來(lái)的載體感染大腸桿菌的效率比質(zhì)粒本身要高得多。一旦進(jìn)入了大腸桿菌，λYES中的質(zhì)粒序列能夠被誘導(dǎo)重組出λ基因組，并進(jìn)行獨(dú)立復(fù)制，這就可以從質(zhì)粒中分離出來(lái)，以便進(jìn)行進(jìn)一步的遺傳操作。       為了最大限度地提高克隆效率，載體用只有一個(gè)切點(diǎn)的限制性內(nèi)切核酸酶 XhoI（5’-C十 TCGAG）進(jìn)行切割，然后在 dTTP 存在的情況下，同 DNA 聚合酶一起進(jìn)行溫育。將一種具有平末端的雙鏈 cDNA 同一段含由兩段寡聚核苷酸組成的雙鏈寡聚核苷酸接頭連接起來(lái)，這兩段寡聚核苷酸的序列是：5’—CGAGATTTACC 和5’—GGTAAATC，它們的 5’端都是磷酸。然后將載體和 cDNA混合并連接在一起。采用這種方法用 2μg的7載體和 0.1μg 的 cDNA，構(gòu)建了一個(gè)有 4×10 個(gè)克隆的 cDNA 文庫(kù)。能夠用XhoI從重組質(zhì)粒中切出cDNA 嗎？